Les milieux d'identification

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 Milieu de Hugh et Leifson

Ce milieu appartient aux milieux MEVAG milieux d'études de la d'attaque des glucides

But

Composition

Principe

Utilisation

Lecture

Remarques

Les bactéries peuvent métaboliser le glucose par deux voies : 

- la voie oxydative (le glucose est dégradé en présence d'oxygène)

- la voie fermentative (le glucose est dégradé par voie fermentative).cf. cours de terminale pour le détail

 Le milieu de Hugh et Leifson permet de déterminer la voie métabolique empruntée par les différentes espèces bactériennes.

On dit ainsi que ce milieu permet de déterminer "la voie d'attaque du glucose".

 

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But

Composition

Principe

Utilisation

Lecture

Remarques

Extrait de levures 1 g Source d'aa et de facteurs de croissance et vitamines.

NaCl

5 g

permet de maintenir une pression osmotique isotonique par rapport à la bactérie.

Peptones pancréatiques

2 g

Sources d'aa , d'azote de carbone et de façon moindre d'énergie

K2HPO4

0,3 g

source d'ions phospates

Agar

3 g

agent gélifiant

Bleu de bromothymol (sol aqueuse à 0,2 g %) 

15 mL

Indicateur coloré de pH permettant de mettre en évidence l'acidification liée à l'utilisation du glucose.

 + Glucose 

Source de carbone et d'énergie.

Il sera ajouté ultérieurement (cf : utilisation) c'est à dire juste au moment de l'utilisation. On dit que cet ajout se fait extemporanément.

Ces quantités s’entendent pour 1 L d’eau distillée.

Ramener le pH final à 7 - 7,2.

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But

Composition

Principe

Utilisation

Lecture

Remarques

On a vu dans le but que ce milieu permettait l’étude des 2 voies métaboliques de dégradation du glucose.

 

Métabolisme fermentatif du glucose

Favorisé par l’anaérobiose, dans ces conditions la dégradation du glucose engendre l’apparition de nombreux produits acides. L’acidification du milieu se traduira par un virage franc de la teinte de l’indicateur de pH.

Métabolisme oxydatif du glucose

Le métabolisme oxydatif ne donne naissance qu’à de petites quantités de composés acides, lorsque les conditions d’oxygénation sont bonnes.

En présence d’oxygène (respiration des bactéries) le glucose est oxydé en CO2 , avec peu de substances acides ; cette légère acidité sera aussi mise en évidence à l’aide d’indicateurs de pH.

Pour déceler un métabolisme oxydatif on doit :

- opérer le plus possible en aérobiose

- utiliser des milieux peu peptonés (peptones qui sont dégradés en produits alcalins).

- utiliser des milieux peu tamponnés pour faciliter la lecture, surtout dans le cas d’une bactérie oxydative qui produise peu d'acide lors de la dégradation du glucose.

- utiliser un milieu suffisamment gélosé pour limiter, la diffusion des composés acides, ainsi que la vitesse de pénétration de l’O2 de l’air.

 

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But

Composition

Principe

Utilisation

Lecture

Remarques

Préparation du milieu :

Attention la préparation de ce milieu se fait en plusieurs étapes.

(1) La phase de régénération=>éliminer les gaz dissout.

- Faire fondre 2 tubes  au bain marie bouillant ( 100°C, 30 min. maximum ) 

Cette phase consiste à éliminer les gaz dissous, comme O2.

(2) L'ajout de la solution concentrée de glucose stérile.

- Ramener en surfusion à 45°C au bain thermostaté.

- Ajouter aseptiquement 6 gouttes de solution stérile de glucose à 30 %, ce qui donne une concentration finale de 1 % dans le milieu.

- Mélanger par agitation douce sans renversement.

(3) Solidification.

Refroidissement du milieu puis solidification dans l’eau froide.

Pour éviter de consommer trop d'eau utiliser un vase commun (n'oublier pas de marquer vos tubes).

Dans certains département comme la Martinique/Guadeloupe/Guyane/Réunion vous pouvez mettre les tubes dans de l'eau froide contenant des glaçons pour améliorer la solidification.

Attention tout de même la solidification du milieu ne sera jamais identique à celle que vous connaissez pour les autres milieux car ce milieu est semi-solide.

hl0001.jpg (15231 octets)

Ensemencement :

- Ensemencer par piqûre centrale au fil droit à partir d’une culture en bouillon de 24 h ou d’une suspension bactérienne de même densité.

- Recouvrir un tube de 0,5 à 1 cm3 d’huile de paraffine stérile, c’est le tube dit " fermé " ou tube "F". L’autre est le tube dit " ouvert " ou "tube O".

hl0003.jpg (13665 octets)

Incubation :

- Incuber 24 h à 37°C.ATTENTION : Le bouchons doit être semi-débloqué pour le tube "O".

Résumé :

hl0014.jpg (15774 octets)

 

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But

Composition

Principe

Utilisation

Lecture

Remarques

On fait simultanément la lecture dans les deux tubes, les résultats permettent d’observer 3 catégories de bactéries .

Caractère

Schématisation des résultats

Photos

Interprétation et résultats

voie d'attaque du glucose

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

hl0010.jpg (2011 octets)

Type fermentatif

hl0004.jpg (4694 octets)

 

 

- Culot jaune

- Virage du rouge du BBT (bleu de bromothymol) révèle l'acidité du milieu

- la bactérie a fermenté le glucose dans le tube F, elle est donc capable de l'utiliser en l'absence d'O2. Le tube confirme qu'elle est capable de l'utiliser en présence d'O2

-Elle est dite Fermentative du glucose = de type fermentatif

hl0011.jpg (2068 octets)

 

- Le tube F est de couleur verte, il n'y a donc pas de virage de l'indicateur coloré, la bactérie n'a donc pas fermenter le glucose.

- Le tubes O présente un zone jaune de virage en surface il y a donc une acidification, la bactérie a utulisé le glucose en aérobiose

-Elle est dite de type oxydatif (incapable d'utiliser le glucose)

hl0013.jpg (2055 octets)

Type inactif

hl0003.jpg (13665 octets)

- Les deux tubes (O et F) sont vert

- Il n'y a pas de virage du BBT

- la bactérie n'a pas fermenté le glucose

-Elle est dite inactive (incapable d'utiliser le glucose)

hl0012.jpg (2116 octets)

Type alacalinisante

hl0005.jpg (4331 octets)

- Les deux tubes (O et F) sont vert et bleu

- Il y a  virage du BBT , le milieu est basique

- la bactérie n'a pas fermenté le glucose mais a utilisé les peptones du milieu.

-Elle est dite alcalinisante (incapable d'utiliser le glucose)

Production de gaz

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

hl0007.jpg (5793 octets)

- Il y a présence de bulles de  gaz

- La bactérie a produit du gaz en fermentant le glucose

- Elle est dite Gaz +  (mais encore "gaz en glucose+")

 

 

- Il n'y a pas de bulles de  gaz

- La bactérie n'a pas produit du gaz en fermentant le glucose

- Elle est dite Gaz -  (mais encore "gaz en glucose-")

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But

Composition

Principe

Utilisation

Lecture

Remarques

Il est important de remarquer le lien entre la lecture de la voie d'attaque du glucose et le type respiratoire mis en évidence sur le milieu VF(contenant lui aussi du glucose). En effet une bactérie qui a un type respiratoire AS (aérobie strict) ne sera pas capable de cultiver en anaérobiose sur milieu HL elle sera donc de type oxydatif ou inactif.

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